产品描述
免疫组库（Immune repertoire，IR）是指特定时间点个体循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞所表达的BCR和TCR的总和。T淋巴细胞和B淋巴细胞是适应性免疫应答的主要执行者，其抗原识别功能依赖于T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）。这两类细胞表面分子的显著特征是高度多样性，能够识别多种抗原分子（同时免疫学中的核心原则是：一个细胞，一种受体）。在不同疾病状态下，免疫组库特别是TCR谱会发生显著变化，这对疾病诊断和治疗具有重要指导意义[1][2]。因此，近年来研究重点逐步聚焦于肿瘤、自身免疫性疾病、炎症及传染病等不同疾病条件下的免疫组库变化[3]。
10x Genomics单细胞免疫组库分析解决方案是一种基于10x Genomics平台的新技术，能够在单细胞水平同时进行转录组基因表达和适应性免疫受体库的高通量测序。该技术可同时获取500-10000个单细胞的5’基因表达数据以及TCR/BCR的V(D)J全长序列，在肿瘤微环境、感染性疾病、器官移植后排斥反应、免疫治疗等研究领域具有广泛应用价值。
1. 技术原理
10x Genomics Chromium™系统的关键技术是利用上百万独特的Barcode标记不同的样品（长链DNA分子/单细胞）。首先，含有Barcode信息的Gel beads与样品和酶的混合物混合，然后与位于微流体“双十字”交叉系统中的油表面活性剂结合形成GEMs（Gel Bead-In-Emulsions，意为包裹Gel beads，样品以及酶的混合物的油滴）。之后，GEMs 流到储液器中并被收集，这是最为关键的步骤。接下来，Gel beads溶解释放Barcode序列，开始对细胞进行标记。将每个液滴中含有Barcode信息的产物混合，构建标准测序文库。10x Genomics Chromium™单细胞V(D)J产品的Gel beads图解如下：
通过“双十字”交叉系统后的步骤如下：
第一步：GEMs形成和Barcode标记。V(D)J建库的barcode序列连接的是switch oligo TSO序列，mRNA先是通过ploy(T)引物反转录，反转录到mRNA 5’末端，在末端加上序列CCC, 与TSO的GGG序列互补配对，实现cDNA的抓取，继续转录从而在5`端cDNA序列加上barcode序列。
第二步：V(D)J区域富集。用5’接头的通用引物和TCR恒定区的连续巢式引物进行巢式PCR，此过程加上测序接头P5，实现TCR/BCR的V(D)J区域富集。
第三步：构建文库。酶消化的方式将V(D)J cDNA随机打断，通过控制打断不同长度而得到的序列，可以覆盖整个V(D)J片段cDNA序列，末端修复加A，再加上测序接头P7，PCR扩增建库。
2. 分析内容
TCR VJ基因使用热图
TCR VJ基因Circos图
3. 参考文献
1. Choudhuri K, Wiseman D, Brown MH, Gould K, Merwe PA van der. T-cell receptor triggering is critically dependent on the dimensions of its peptide-mhc ligand. Nature. 2005;436:578–82.
2. Mohan JF, Unanue ER. Unconventional recognition of peptides by t cells and the implications for autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 2012;12:721–8.
3. Qiao S-W, Christophersen A, Lundin KE, Sollid LM. Biased usage and preferred pairing of α-and β-chains of tcrs specific for an immunodominant gluten epitope in coeliac disease. International immunology. 2014;26:13–9.
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植物单细胞测序
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